嘔吐毒素對斷奶仔豬生長性能、免疫和腸道微生物的影響及益康脫毒效果評估

時間:2020-05-19    點擊:865


孫鋁輝1,劉強2,Niel Karrow3


1、華中農業大學 教授,2、江蘇奧邁生物科技有限公司 研發總監,3、加拿大圭爾夫大學 教授
為方便您的閱讀,已將英文譯成中文版,內容如下:

  (原文已附本文末尾)


1 背景

      脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(嘔吐毒素,DON),主要由鐮刀菌屬產生的真菌毒素,是全世界谷物作物中最常見的霉菌毒素之一(Schothorst 等,2004)。研究報道人和家畜攝入含有嘔吐毒素污染的食品或飼料后會導致其拒食、嘔吐、免疫力下降和腸道疾病的發生(Sobrova 等,2010)。所有的動物中,豬對嘔吐毒素非常敏感(Rotter  等,1996),由于豬飼料中玉米和小麥的比例很高,所以嘔吐毒素對其危害的風險更大。嘔吐毒素在小腸上部,尤其是回腸,被快速有效的被吸收(Etienne 等,2008)。如果動物攝入足夠高濃度的嘔吐毒素,則會引起炎癥反應,從而損害粘膜上皮細胞屏障,并可導致營養物質的吸收,以及構成腸道內條件致病性微生物的生長(Pestkaand Smolinski, 2005;Bouhetand Oswald, 2005;Park 等,2017)。

      豬腸道健康取決于腸道菌群的多樣性和穩定性(Hopwood  等,2002),而真菌毒素會導致腸道微生物菌群生態失調(Robert 等,2017),特別是在斷奶時期,因為此時仔豬飲食突然變化引起的腸道菌群失調是導致斷奶仔豬腹瀉的主要原因(Gresse 等,2017)。雖然腸道微生物群失調與 DON 誘導的厭食相關(Peng  等, 2017),但很少有研究探究了 DON  對腸道微生物群落的直接影響,報告結果也不一致。例如,仔豬飼喂 DON 污染的飼料,發現其糞便中好氧嗜溫菌數量減少, 同時,日增重和采食量的降低(Wache  等,2009)。相反,另一個研究顯示,大鼠口服 DON 后,其腸道內大多數微生物沒有發生明顯變化(Saint-Cyr 等,2013)。 DON 誘導的腸道損傷和腸道微生物菌群穩態的關系尚不清楚,需要進一步研究。由于 Illumina-MiSeq 高通量測序技術最近已被應用于人類和實驗動物腸道微生物研究(David 等,2014; Yang 等,2017),利用該技術研究腸道微生物群菌群多樣性的變化可有助于我們更好地了解 DON 對仔豬腸道健康的影響。

      除了胃腸道損傷外,免疫系統也是 DON 毒性的主要靶標(Pestka 等,2004)。據報道,攝入 DON 污染的飼料可影響不同物種的免疫應答,包括嚙齒類動物、人類、禽類和豬(Barbara  等,1996)。例如,前人研究報道斷奶仔豬采食 DON污染的飼料(2.5mg DON/kg)后能顯著增加其卵白蛋白(OVA)-特異性免疫球蛋白 IgA 的含量(Pinton 等,2008)。由于 IgA 是粘膜表面的主要免疫球蛋白,這可能與反饋性增加對腸道病原體的抵抗有關(Li 等,2005)。由于用新型抗原(如 OVA)免疫刺激機體,檢測機體的免疫應答反應是評估免疫系統對商業疫苗和病原體攻擊反應狀況的有效的間接方法,該方法能有效用于評價DON 誘導的免疫應激對動物健康的影響(Pestka 等,2003)。

 

2 研究目的

研究 DON 對斷奶仔豬生長性能、免疫和腸道微生物菌群的影響及AmdetoxTM 脫毒劑脫毒效果評估。

 

3 實驗設計

3.1  仔豬、飼料和試驗設計

    本試驗選取 28 頭斷奶仔豬(3 周齡),隨機分配到 4 個處理組,每組 7 頭,每頭仔豬飼養于 1 個代謝籠。第 1 組飼喂基礎(BD),其日糧滿足 NRC(2012)的營養需要量,其它 3 組飼喂 BD 分別添加 1.0 mg/kg DON、3.0 mg/kg DON 及3.0 mg / kg DON + 0.05%Amdetox(AmdetoxTM 脫毒劑為江蘇奧邁產品)。在飼養試驗的第 1 和 2 周末時接種 OVA(加佐劑 Quil A)、偽狂犬疫苗、豬瘟疫苗、豬圓環病毒疫苗(注意:接種劑量為商業用量的一半)。在試驗的第 2、3 和 4 周末時采血。此外,在試驗的第 3 及 4 周末時用OVA 做皮試,檢測第 0、3、6 及 24h 的皮試反應。試驗結束后(第 4 周末),屠宰仔豬采集血液、腸道(十二指腸、空場及回腸)及腸道微生物樣本用于后續分析。


  

3.2 檢測指標
生長性能記錄試驗期間仔豬每周的體重及采食量,計算其日增重和飼料轉化率。
血清生化采集仔豬試驗期第 2、3 和 4 周時的血液,測定 LPS 的濃度及OVA、偽狂犬病、豬瘟的血清抗體滴度。
腸道抗氧化指標通過比色法測定腸道樣品中 SOD、及 T-AOC 活性以及GSH 和丙二醛(MDA)含量。
組織學評估十二指腸、空腸和回腸組織病理變化。
腸道微生物分析:用 Illumina-MiSeq 高通量測序技術將檢測豬的腸道(十二指腸、空腸和回腸)微生物菌群變化。


3.3 統計分析
使用SPSS 13 版(Chicago,IL,USA)進行統計分析。數據以平均值±標準誤形式表示。數據將通過 Tukey-kramer 方法進行多重比較,組間差異 P < 0.05 表示差異顯著。


4 試驗結果及分
4.1 日糧中各毒素含量

4.2 生長性能指

       由表 3 可知,與對照組相比,日糧添加 DON 為 1.0 mg/kg 能顯著降低(P < 0.05)仔豬在 1-2 周、3-4 周及 1-4 周的體增重(16.0-60.8%)和(或)采食量(18.1-38.7%)及顯著增加(P  <  0.05)1-4  周的料肉比(12.8%)。與日糧添加1.0mg/kgDON 組相比,日糧添加 3.0mg/kg DON 能進一步降低(P < 0.05)仔豬3-4  周體增重(21.2%)和采食量(21.7%)。值得注意的是,日糧中添加 0.05%的 Amdetox 脫毒劑能有效的緩解 3.0mg/kg DON 對仔豬在 1-2 周、3-4 周及 1-4 周的體增重、采食量和(或)料肉比的危害。


4.3 血清生化指標及抗體滴


由表 4 可知,與對照組相比,盡管日糧添加 1.0 及 3.0  mg/kg DON 對DAO無顯著(P >  0.05)影響,但其能顯著增加(P <  0.05)仔豬血清 LPS  的含量(46.2-51.4%)。值得注意的是,日糧添加 0.05%的 Amdetox 脫毒劑能有效的抑制(P < 0.05)DON 至仔豬血清LPS 濃度的上升。

注:結果表示為平均數±標準誤(n=7),同行肩標不同小寫字母表示差異顯著(P  <0.05)。 Arbitrary unit, 相同度量條件下各數據間的相對大小值。

由表 5 可知,與對照組相比,日糧添加 1.0 及 3.0 mg/kg DON 對可降低(P < 0.05)仔豬第四周血清中圓環抗體滴度(33.1-40.1%),而日糧添加 0.05%的 Amdetox 脫毒劑能有效的緩解DON 對豬血清圓環抗體滴度的影響。此外,日糧添加 DON 及 0.05%的 Amdetox 脫毒劑對仔豬血清中狂犬抗體滴度、瘟抗體滴度及OVA 抗體滴度無顯著(P > 0.05)影響。


4.4 腸道抗氧化指
由表 6 可知,與對照組相比,日糧添加 1.0 及 3.0 mg/kg DON 對十二指腸、空腸及回腸 T-AOC 及MDA 無顯著(P > 0.05)影響,而日糧添加 0.05%的Amdetox脫毒劑能增加(P < 0.05)空腸 T-AOC 和降低(P < 0.05)回腸MDA 含量。此外,日糧添加 DON 及Amdetox 脫毒劑能提升十二指腸、空腸及回腸 SOD 和(或) GSH 含量(此結果與預期相反,可能是反饋性調控)。

4.5 腸道組織學變
由圖 1A 可知,和對照組相比,日糧添加 1.0 及 3.0 mg/kg DON 使得仔豬十二指腸絨毛上皮細胞壞死脫落,絨毛斷裂脫落。固有層水腫,炎性細胞增多。由圖 1B 可知,日糧添加 1.0 mg 及 3.0 mg/kg DON 使得仔豬空腸出現輕微腸絨毛上皮變性壞死。由圖 1C 可知,和對照組相比,日糧添加1.0 mg 及 3.0 mg/kg DON 使得仔豬回腸淋巴細胞增生,腸絨毛上皮細胞變性壞死脫落,固有層水腫。值得注意的是,日糧添加 0.05%的Amdetox 脫毒劑組中十二指腸、空腸及回腸未見明顯病理變化(圖 1A-C)。
圖 1 (A)十二指腸、(B)空腸及(C)回腸組織形態學變化

4.6 腸道微生物變化
4.6.1 腸道 Alpha 多樣性變化
48 個腸道內容物樣品(三個腸段:十二指腸、空腸、回腸)總共得到 1915624 條序列。平均序列量 39908 條,每個序列平均長度 421bp。不同處理組仔豬內容物微生物在97%相似性閾值上多樣性指數見表 7。

與對照組相比,日糧添加 1.0 及 3.0 mg/kg DON 使得仔豬十二指腸、空腸及回腸 chao1 指數顯著升高,表明日糧添加 DON 增加了仔豬小腸菌群豐度,而日糧 0.05%的 Amdetox 脫毒劑組中未影響十二指腸中的chao1 指數。此外,日糧中添加DON 及 0.05%的 Amdetox 脫毒劑對仔豬十二指腸、空腸及回腸 Shannon 指數無顯著影響,表明其對仔豬小腸菌群多樣性無顯著影響。


4.6.2 腸道分類學組成變化

日糧添加 DON 對仔豬小腸微生物在門水平優勢菌群影響見圖 2。在門水平上,仔豬十二指腸、空腸及回腸的優勢菌群均為放線菌門(Actinobacteria)、藍藻門(Cyanobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)。與對照組相比,日糧添加 1.0 和(或)3.0 mg/kg DON 使得仔豬十二指腸、空腸及回腸中藍藻門相對豐度上升,而變形菌門和厚壁菌門相對豐度下降;日糧添加1.0 和 3.0 mg/kg DON 使得仔豬十二指腸及回腸中放線菌門相對豐度上升,而使得空腸中放線菌門相對豐度下降。此外,日糧中添加 DON 及 0.05%的 Amdetox 脫毒劑使得 DON 導致小腸菌群紊亂得到一定的改善。

圖 2(A)十二指腸、(B)空腸及(C)回腸門水平優勢菌群相對豐度

日糧添加 DON 對仔豬小腸微生物在屬水平優勢菌群影響見圖 3。在屬水平上,仔豬十二指腸、空腸及回腸的優勢菌群均為乳酸桿菌(Lactobacillus)、貪銅菌(Cupriavidus)、不動桿菌(Acinetobacter)、伯克氏菌(Burkholderia)、葡萄球菌(Staphylococcus)、蒼白桿菌(Ochrobactrum)、棒狀桿菌(Corynebacterium)及鏈球菌(Streptococcus)。與對照組相比,日糧添加 1.0 和 3.0 mg/kg DON 使得仔豬十二指腸、空腸及回腸中總的優勢菌群下降。其中,與對照組相比,日糧添加 1.0 和(或)3.0 mg/kg DON 使乳酸桿菌和貪銅菌的豐度降低,而使得葡萄球菌的豐度上升。然而,日糧添加 1.0 和 3.0 mg/kg DON 使得仔豬十二指腸及空腸中伯克氏菌相對豐度下降,而使得回腸中伯克氏菌相對豐度上升。此外,日糧中添加 DON 及 0.05%的 Amdetox 脫毒劑能改善 DON 導致的小腸菌群紊亂。

 

 圖 3(A)十二指腸、(B)空腸及(C)回腸屬水平優勢菌群相對豐度

5 試驗總結

由本試驗可得出以下主要結論

(1) 日糧添加 1.0 和 3mg/kg  DON 能顯著降低仔豬在 1-2 周、3-4 周及 1-4 周的體增重、采食量和(或)料肉比,而日糧中添加 0.05%Amdetox 脫毒劑能有效緩解 DON 至仔豬生產性能的危害。

(2) 日糧添加 1.0 及 3.0 mg/kg DON 能降低仔豬第四周血清中圓環抗體滴度、增加血清 LPS 的含量。同時,病理切片結果顯示,日糧添加 1.0 及 3.0 mg/kg DON 使得仔豬十二指腸、空腸及回腸絨毛上皮細胞壞死脫落、絨毛斷裂脫落、固有層水腫及炎性細胞增多。此外,這邊變化與其損傷腸道抗氧化平衡有關。而日糧中添加 0.05%Amdetox 脫毒劑能有效緩解 DON 至仔豬血清免疫指標及腸道健康的損傷。

(3) 日糧添加 1.0 及 3.0 mg/kg DON 能提高了斷奶仔豬小腸腸道微生物的豐富度。其中,日糧添加 1.0 和(或)3.0 mg/kg DON 使得仔豬小腸腸道乳酸桿菌和貪銅菌的豐度降低,而使得葡萄球菌的豐度上升。此外,日糧中添加 DON及 0.05%的Amdetox 脫毒劑能有效緩解DON 導致的仔豬小腸菌群紊亂。


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